應(yīng)用安全無(wú)毒的天然食用色素代替合成食用色素是大勢(shì)所趨。但天然色素比合成色素價(jià)格高，因此充分利用價(jià)廉的天然資源制取食用色素是降低成本的重要途徑之一。
山茶花（Camellia japonica L.s）為山茶科山茶屬植物，又名茶花、山茶、耐冬。山茶花一般春季開花，園藝品種繁多，其中深紅色重瓣山茶花具有豐富的紅色素，是開發(fā)天然紅色素的良好資源。山茶花性甘涼而味苦辛，為涼血、止血、散瘀、消腫的良藥，故山茶花紅色素具有天然食用色素安全、營(yíng)養(yǎng)、藥用等典型特怔。利用微波技術(shù)提取天然產(chǎn)物，具有速度快，能耗低，溶劑量少等特點(diǎn)本試驗(yàn)以山茶花為原料，采用微波法對(duì)影響其紅色素提取的主要因素用正交試驗(yàn)，以吸光度值為指標(biāo)，用方差分析方法進(jìn)行分析，從而優(yōu)選山茶花紅色素的微波提取條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用山茶花紅色素提供科學(xué)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
山茶花：采自麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)部校區(qū)，所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。北京瑞利uV一9100型紫外可見光譜儀，DZF一9070型真空干燥箱，AL204型電子分析天平，數(shù)顯恒溫水浴鍋HH一2，RE52CS一1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，GalanzWD800微波爐。
1.2方法
1.2.1提取工藝流程
新鮮山茶花花瓣一清選一晾干切碎一稱重一pH1的95％乙醇微波浸提一過(guò)濾一紅色澄清透明液體一復(fù)提一合并色素液一濃縮精制成暗紅色膏狀色素。
1.2.2平行試驗(yàn)
稱取5.O000g茶花花瓣若干份，分別在不同的微波功率、提取時(shí)間、提取劑用量、提取次數(shù)等條件下做單因子平行試驗(yàn)，各提取液分別以相應(yīng)提取劑作參比，用紫外可見光譜儀在540nm處測(cè)量吸光度值A(chǔ)。
1.2-3正交試驗(yàn)
采用L9（3）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)提取次數(shù)、微波功率、提取時(shí)間、提取劑用量4因子在3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)選，見表l。按1.2_2的方法在540nnl處測(cè)量各樣品的吸光度A。結(jié)果采用直觀分析和方差分析，影響色素提取因子的顯著性檢驗(yàn)采用Duncan法。
表1優(yōu)化提取條件正交試驗(yàn)的因子水平
2結(jié)果與分析
2.1光譜特征測(cè)定
按上述方法提取色素，將95％7,醇pHl提取的山茶花紅色素母液，稀釋至一定體積后，在400nm～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光度值（圖1），結(jié)果表明，95％乙醇提取液的最大吸光度在540nm處，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因所得吸光度值與濃度成正比，故選用相應(yīng)的吸光度值為指標(biāo)恒量色素液濃度。
圖1山茶花紅色素吸收光譜特性
圖2微波功率、提取時(shí)間、提取劑用量、提取次數(shù)對(duì)提取效率的影響
2.2平行試驗(yàn)
2.2.1微波功率的選擇
對(duì)提取功率144W、288W、464W、648W、800W進(jìn)行了平行試驗(yàn)，測(cè)定其540nnl處吸光度值（圖2A）表明，在800W時(shí)其吸光度最大，說(shuō)明微波功率以800w最佳。為了確定在多因子條件下與單因子條件下的最佳微波功率是否吻合，因此選定微波功率464W、648W、800W作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。
2.2.2提取時(shí)間的選擇
對(duì)提取時(shí)間20s、30s、50s、70s、90s、110s進(jìn)行了平行試驗(yàn)，測(cè)其540nnl處吸光度（圖2B）表明，提取時(shí)間以90s為最佳。為了確定在多因子條件下與單因子條件下的最佳提取時(shí)間是否吻合，因此選定提取時(shí)間70s、90s、l10s作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。
2-2-3提取劑用量的選擇對(duì)提取劑（g／mL）用量l：6、l：8、l：10、l：12進(jìn)行了平行試驗(yàn)，測(cè)其540nln處吸光度值（圖2C）表明，在料液比l：10時(shí)吸光度值最大。因此選定料液比l：8、l：10、l：12作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。
2.2.4提取次數(shù)的選擇
對(duì)提取l、2、3、4、5次分別進(jìn)行了平行試驗(yàn)，測(cè)其540nln處吸光度值（圖2D）表明，提取5次時(shí)時(shí)吸光度值最大。通過(guò)Duncan法檢驗(yàn)，結(jié)果顯示后3者之間差異不顯著。從節(jié)約能源和提高提取率考慮，因此選定提取l、2、3次作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。
2-3正交試驗(yàn)
2-3.1正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析
各試驗(yàn)號(hào)根據(jù)具體給定的提取條件所得的提取液，用相應(yīng)提取劑分別定容于100mL容量瓶中，在540nln處分別測(cè)其吸光度值CA）。由表2可看出，在正交試驗(yàn)的4個(gè)因子中，以提取次數(shù)對(duì)提取率的影響最大，由極差數(shù)據(jù)K可見，各因子對(duì)提取率的影響依次為：提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取料液比、提取微波功率。直觀分析正交試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳工藝條件為A。BC3D，即提取劑用pHl的95％乙醇溶液時(shí)，料液比l：8（g／mE），提取時(shí)間l10s，提取微波功率為464W，提取3次。
表2優(yōu)化提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果
2.3.2方差分析
由試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析表3可知，因子D為極顯著性因子，因子B為顯著性因子，需進(jìn)一步分析確定。因子A、C為不顯著因子，可以綜合考慮確定，由后面Duncan法檢驗(yàn)后確定。
表3方差分析
2.3.3Duncan法分析
先分別求出A、B、D因素水平間的ro.0l，ro.05和Rk值然后再根據(jù)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行各因素水平顯著性比較。結(jié)果表明，提取時(shí)間l10s與90s、l10s與70s之間差異顯著，而90s與70s之間差異不顯著；提取次數(shù)各水平之間差異顯著或極顯著；提取劑用量各水平之間差異均不顯著。
表4A、B、D因素4水平顯著差異比較
其次，計(jì)算9個(gè)試驗(yàn)所得吸光度值相互間ro.0l，ro.05和Rk值，再根據(jù)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行9個(gè)處理間顯著差異比較。表5結(jié)果表明，表中處理3與8差異不顯著，但與其他處理均存在顯著或極顯著差異，故可任選處理3或8其中之一。由表4分析知，A因素中提取劑用量各水平之間差異均不顯著；B因素中提取時(shí)間1lOs與70s之間差異顯著；D因素中提取次數(shù)各水平之間差異均顯著或極顯著。綜合考慮能源、方便等因素，最優(yōu)化的微波提取條件為：用pH1的95％乙醇溶液作提取劑，料液比1：8（g：mL），提取時(shí)間110s，微波功率為464W，提取3次。該結(jié)論與正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果完全吻合。
2.4對(duì)比試驗(yàn)
各試驗(yàn)號(hào)根據(jù)具體給定的提取條件所得的提取液，用相應(yīng)提取劑分別定容于250mL容量瓶中，在540nm~分別測(cè)其吸光度A。由表6看出，與溶劑浸提法相比，采用微波法提取山茶花果紅色素提取每次提取時(shí)間由2h減小為110s，提取率從81.8％增加到84.7％。
2.5色素提取率
分別稱取一定量的山茶花花瓣，按微波最佳條件提取紅色素，20℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，經(jīng)20℃干燥，可得深紅色固體。經(jīng)3次平行試驗(yàn)證明，色素粗提產(chǎn)率為7.9％。
表5試驗(yàn)組間顯著性差異比較
表6對(duì)比試驗(yàn)
3討論與結(jié)論
山茶花花瓣中含有豐富的天然色素，尤其是深紅色的重瓣山茶花其色素色澤艷麗含量更高，是極具開發(fā)前景的天然色素資源。試驗(yàn)表明：用1：8（g／mL）的95％乙醇（pH1）溶液，微波功率464W，提取時(shí)間110s，提取次數(shù)3次，提取效率較好。方差分析結(jié)果，雖然微波功率為非顯著性因子，但同樣能體現(xiàn)微波法提取的速度快能耗低的特點(diǎn)。試驗(yàn)表明，最佳工藝條件下色素的提取率為84.7％，產(chǎn)率為7.9％。與常規(guī)溶劑浸提法相比，微波法提取每次提取時(shí)間由2h減少為110s，提取率從81.8％增加到84.7％。所以，用微波協(xié)助法提取山茶花紅色素效果更佳。
